생화학 실험-pNP assay를 이용한 효소 기질 반응(종료)

생화학 실험의 마지막 실험인 효소 기질 반응 측정이다.우리가 실험으로 정제한 단백질은 Lip C12다.이 단백질은 Lipase이며 물의 양에 따라 가수분해 및 ester bond를 형성하는 효소이다.기질과 lipase의 반응 정도를 측정하는 것이 이번 실험의 목표다.우선 PNP란 무엇인가?

p-NPA <-> pNP+아세트산(예시)

p-NPA <-> pNP+아세트산(예시)

pNP-ester가 가수 분해되고 pNP와 Carboxyl group가 생성되고, 이 반응에 기여하는 효소가 lipase입니다.이 반응을 이용하여 효소가 얼마나 기질을 반응시키는지 실험합니다.PNP는 405-420nm에서 흡수를 갖지만, 효소를 이용하고 PNP를 생성하고 O.D. 값을 측정하고 얼마나 많은 PNP가 생성됐는지를 측정하는 것입니다.첫 실험 방법입니다.1. 10 mM p NP stock용액을 각 1.5 ml tube에0 mM, 0.2 mM, 0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM, 1 mM이 되도록 분주합니다.-total volume 200ul로 dilution(Stock:pNP in triethyl phosphate)2.각 1.5ml tube에 50 mM Tris HCl(pH 7.5)를 total volume이 200ul이 되게 넣어 줄래3. Vortexing, spin down진행 4.96 well plate에 각 용액을 100ul씩 넣어 줄래5. 405nm에서 흡수를 측정하는6. pNP농도별로 측정된 card를 이용하고 sturvesturves를 이용합니다.2번째 실험 방법입니다.1. 제시된 조성으로 96 well plate에서 2개 well을 사용하고 각각 mixture를 만들2.30℃에서 20분 반응 3.405nm에서 흡수도를 측정합니다 100ul tube(a, b)두개를 만들지만 a:효소 xb:효소 O이다, 기질(pNP-ester:1mM)의 농도와 양은 a, b함께 마찬가지로 b에 들어간 효소의 양만 tris-Cl을 적게 넣었습니다.요약하면 처음의 실험은 pNP용액을 이용하고 standard curve를 그리는 것입니다.pNP가 각각의 농도일 때 갖고 O.D. 값으로 standard curve로 표시했으며 2번째 실험에서 대조군과 실험 군을 만들어 효소-기질 반응 정도를 측정하는 것입니다.PNP의 농도를 0.2m씩 올리며 O.D. 값을 측정하고 stadnard curve를 그립니다.각 농도마다 O.D. 값을 측정하고 표를 작성하면 다음과 같습니다.

2번째 실험의 기질인 PNP-ester는 405nm에서 흡수를 가지지 않기 때문에, a는 negative control의 역할을 한다.b는 효소가 반응물을 생성물인 PNP으로 전환하면서 405nm에서 다량의 흡수를 갖는다.(b:효소 O의 O.D. 값)-(a:효소 X의 O.D. 값)을 y에 대입하여 계산한 x값은 효소가 얼마나 기질을 반응시켰는지 즉 전환률을 뜻한다.실험 결과 약 74%가 나왔다.전환율은 다른 방법도 검토할 수 있지만 실험 2에서 사용한 PNP기질의 농도는 1 mM이다.그리고 실험 1에서 PNP의 농도가 1mM때, 즉 well의 6번 흡광 때 O.D값은 1.9832이지만, 즉 PNP ester가 1mM때 100%생성물로 전환되면 그때의 O.D. 값이 1.9832라는 것이다.우리의 실험 2의 결과는 1.5278이므로 1.5278/1.9832의 77%이다.약 3%뿐 차이가 발생하는 이유는 standard curve가 정확히 0.4분씩 비례하며 상승하지 않았기 때문이다.또 위에서 계산한 선택율은 enzyme을 처리한 mixture의 흡광-pNP 0 mM때 흡광 blank이며, 아래에서 enzyme을 처리한 mixture의 흡광-enzyme을 처리하지 않는 mixture의 흡수도이기 때문에 3%뿐 차이가 발생한 것이다.standard curve와 mM에 대한 정확한 개념이 있어야 이번 실험을 완전히 이해할 수 있어 추가적인 설명을 가하다.standard curve는 모델을 이론적으로 계산한 그래프를 의미하는데 pNP가 0.2mM씩 증가할 때마다 이론상 흡광도가 0.4씩 오를 것을 기반으로 실험 1을 추진하고 만든 것이 위의 standard curve이다.다음에 M은 mol/L을 의미하는 농도 단위이다.PNP1mM:PNP-1mol이 1L속에 녹아 있다는 뜻이다.그럼 PNP-ester 1mM이 모두 반응하면 PNP와 acetic acid이 각각 무엇 mM씩 생성되는가?정답은 1mM, 1mM이다. 0.5mM이라고 생각하면 오산이다.그 이유는 mM은 농도의 단위이기 때문이다.예컨대 10%-1L의 소금물을 비커 둘로 나눌 때 각각의 농도는 각각 10%이다.왜냐하면 소금의 양과 마찬가지로 전체의 Volume의 양도 절반이 되기 때문이다.다시 한번 예를 들면 1mM의 PNP-ester가 0.2mM정도로 전환되면 생성물은 각각 0.2mM의 농도를 갖는다.이번 실험을 포함, 총 5번의 실험에서 생화학 실험을 마치고 stadnard curve을 엑셀로 그리는 방법은 별도로 작성할 예정이다.